Miss Night and Day menghadirkan kisah seru tentang dua sosok dalam satu tubuh. Lee Mi Jin (Jung Eun Ji) ialah perempuan berusia 28 tahun yang sedang mempersiapkan untuk ujian pegawai negeri, tapi ia selalu gagal berkali-kali.
Sampai suatu malam Mi Jin mengalami kejadian misterius yang mengubahnya jadi sosok Lim Sun (Lee Jung Eun). Ia merupakan perempuan tua berusa 50 tahun, tapi tenaganya begitu kuat bak anak muda 20-an tahun.
Setelah berbagai masalah yang dihadapinya, akhirnya ia menjadi pekerja di Kantor Kejaksaan Distrik Seohan. Ada beragam karakter pekerja di kantor tersebut. Siapa saja mereka?